Репозиторий Университета

© 2019 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. Background: Covalently closed circular DNA (cccDNA) of hepatitis B virus (HBV) is the major cause of viral persistence in patients with chronic HBV infection. Understanding the mechanisms underlying stability and persistence of HBV cccDNA in hepatocytes is critical for developing novel therapeutics and managing chronic hepatitis B. In this study, we observed an unexpected increase in HBV cccDNA levels upon suppression of transcription by de novo DNA methyltransferase DNMT3A and uncovered additional mechanisms potentially involved in HBV cccDNA maintenance. Methods: HBV-expressing cell lines were transfected with a DNMT3A-expressing plasmid. Real-time PCR and HBsAg assays were used to assess the HBV replication rate. Cell cycling was analyzed by fluorescent cell sorting. CRISPR/Cas9 was utilized to abrogate expression of APOBEC3A and APOBEC3B. Alterations in the expression of target genes were measured by real-time PCR. Results: Similar to previous studies, HBV replication induced DNMT3A expression, which in turn, led to reduced HBV transcription but elevated HBV cccDNA levels (4-to 6-fold increase). Increased levels of HBV cccDNA were not related to cell cycling, as DNMT3A accelerated proliferation of infected cells and could not contribute to HBV cccDNA expansion by arresting cells in a quiescent state. At the same time, DNMT3A suppressed transcription of innate immunity factors including cytidine deaminases APOBEC3A and APOBEC3B. CRISPR/Cas9-mediated silencing of APOBEC3A and APOBEC3B transcription had minor effects on HBV transcription, but significantly increased HBV cccDNA levels, similar to DNMT3A. In an attempt to further analyze the detrimental effects of HBV and DNMT3A on infected cells, we visualized γ-H2AX foci and demonstrated that HBV inflicts and DNMT3A aggravates DNA damage, possibly by downregulating DNA damage response factors. Additionally, suppression of HBV replication by DNMT3A may be related to reduced ATM/ATR expression. Conclusion: Formation and maintenance of HBV cccDNA pools may be partially suppressed by the baseline expression of host inhibitory factors including APOBEC3A and APOBEC3B. HBV inflicts DNA damage both directly and by inducing DNMT3A expression.

Chronic hepatitis B virus infection (CHB) caused by the hepatitis B virus (HBV) is one of the most common viral infections in the world. Reactivation of HBV infection is a life-threatening condition observed in patients with CHB receiving chemotherapy or other medications. Although HBV reactivation is commonly attributed to immune suppression, other factors have long been suspected to play a role, including intracellular signaling activated in response to DNA damage. We investigated the effects of DNA-damaging factors (doxorubicin and hydrogen peroxide) on HBV reactivation/replication and the consequent DNA-damage response. Dose-dependent activation of HBV replication was observed in response to doxorubicin and hydrogen peroxide which was associated with a marked elevation in the mRNA levels of ataxia-telangiectasia mutated (ATM) and ATM- and RAD3-related (ATR) kinases. Downregulation of ATM or ATR expression by shRNAs substantially reduced the levels of HBV RNAs and DNA. In contrast, transcriptional activation of ATM or ATR using CRISPRa significantly increased HBV replication. We conclude that ATM and ATR are essential for HBV replication. Furthermore, DNA damage leading to the activation of ATM and ATR transcription, results in the reactivation of HBV replication.

© 2018 American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Reproduction of RNA viruses is typically error-prone due to the infidelity of their replicative machinery and the usual lack of proofreading mechanisms. The error rates may be close to those that kill the virus. Consequently, populations of RNA viruses are represented by heterogeneous sets of genomes with various levels of fitness. This is especially consequential when viruses encounter various bottlenecks and new infections are initiated by a single or few deviating genomes. Nevertheless, RNA viruses are able to maintain their identity by conservation of major functional elements. This conservatism stems from genetic robustness or mutational tolerance, which is largely due to the functional degeneracy of many protein and RNA elements as well as to negative selection. Another relevant mechanism is the capacity to restore fitness after genetic damages, also based on replicative infidelity. Conversely, error-prone replication is a major tool that ensures viral evolvability. The potential for changes in debilitated genomes is much higher in small populations, because in the absence of stronger competitors low-fit genomes have a choice of various trajectories to wander along fitness landscapes. Thus, low-fit populations are inherently unstable, and it may be said that to run ahead it is useful to stumble. In this report, focusing on picornaviruses and also considering data from other RNA viruses, we review the biological relevance and mechanisms of various alterations of viral RNA genomes as well as pathways and mechanisms of rehabilitation after loss of fitness. The relationships among mutational robustness, resilience, and evolvability of viral RNA genomes are discussed.

Репликативный полипротеин 1а вируса желтухи свеклы (ВЖС) содержит консервативные домены лидерной папаин-подобной протеиназы (РСР), метилтрансферазы (MTR) и РНК хеликазы (HEL). Центральный район (central region, CR) между MTR и HEL ранее считали «вариабельным». Нами проведен компьютерный анализ CR, который позволил выявить новый консервативный домен между позициями 1287-1390 (здесь и далее приводится нумерация аминокислотных остатков белка 1а вируса желтухи свеклы, BYV), сохраняющийся у всех представителей рода Closterovirus. Этот домен содержит 4 предсказанных альфа-спиральных участка (альфа А – D) и три строго консервативные позиции – глютамат-1291, пролин-1380 и аргинин-1384. Кроме того, биоинформатический анализ позволил предсказать амфипатическую спираль в позициях 1368-1380 (входящую в состав участка альфа D). Гидрофобный домен CR-2 (позиции 1305-1494 белка 1а), вызывающий при экспрессии в растениях реструктуризацию эндоплазматического ретикулюма и образование подвижных глобул диаметром ~1 мкм, включает участки альфа В, С и D. Установлено, что экспрессия в растениях слитных белков CR-2:GFP и GFP:CR-2 вызывает сходный «глобулообразующий» фенотип, т.е. N-концевое или C-концевое положение маркера GFP в слитном белке не влияет на переформатирование мембран эндоплазматического ретикулюма. Проведен делеционный анализ CR-2 BYV. Показано, что делеционные варианты 1355-1494 и 1325-1484 сохраняют фенотип дикого типа (образование глобул и реструктуризация ЭР вокруг ядра клетки). Варианты 1375-1484, 1368-1484 и 1368-1432 индуцировали образование глобул, но утрачивали способность к реструктуризации ЭР. Внесение замен гидрофобных аминокислотных остатков на остатки серина и глицина в «минимальном» делеционном мутанте 1368-1432 блокировало образование глобул. Предложена рабочая гипотеза о влиянии консервативной амфипатической спирали 1368-1385 в белке 1а BYV на ремоделирование мембран ЭР растительной клетки и создание репликативных платформ при клостеровирусной инфекции.

Репликативный полипротеин 1а вируса желтухи свеклы (ВЖС) содержит консервативные домены лидерной папаин-подобной протеиназы (РСР), метилтрансферазы (MTR) и РНК хеликазы (HEL). Центральный район (central region, CR) между MTR и HEL ранее считали «вариабельным». Нами проведен компьютерный анализ CR, который позволил выявить новый консервативный домен между позициями 1287-1390 (здесь и далее приводится нумерация аминокислотных остатков белка 1а вируса желтухи свеклы, BYV), сохраняющийся у всех представителей рода Closterovirus. Этот домен содержит 4 предсказанных альфа-спиральных участка (альфа А – D) и три строго консервативные позиции – глютамат-1291, пролин-1380 и аргинин-1384. Кроме того, биоинформатический анализ позволил предсказать амфипатическую спираль в позициях 1368-1380 (входящую в состав участка альфа D). Гидрофобный домен CR-2 (позиции 1305-1494 белка 1а), вызывающий при экспрессии в растениях реструктуризацию эндоплазматического ретикулюма и образование подвижных глобул диаметром ~1 мкм, включает участки альфа В, С и D. Установлено, что экспрессия в растениях слитных белков CR-2:GFP и GFP:CR-2 вызывает сходный «глобулообразующий» фенотип, т.е. N-концевое или C-концевое положение маркера GFP в слитном белке не влияет на переформатирование мембран эндоплазматического ретикулюма. Проведен делеционный анализ CR-2 BYV. Показано, что делеционные варианты 1355-1494 и 1325-1484 сохраняют фенотип дикого типа (образование глобул и реструктуризация ЭР вокруг ядра клетки). Варианты 1375-1484, 1368-1484 и 1368-1432 индуцировали образование глобул, но утрачивали способность к реструктуризации ЭР. Внесение замен гидрофобных аминокислотных остатков на остатки серина и глицина в «минимальном» делеционном мутанте 1368-1432 блокировало образование глобул. Предложена рабочая гипотеза о влиянии консервативной амфипатической спирали 1368-1385 в белке 1а BYV на ремоделирование мембран ЭР растительной клетки и создание репликативных платформ при клостеровирусной инфекции.