Репозиторий Университета

© 2018 Acta Materialia Inc. Quantitative measurement of pH and metabolite gradients by microscopy is one of the challenges in the production of scaffold-grown organoids and multicellular aggregates. Herein, we used the cellulose-binding domain (CBD) of the Cellulomonas fimi CenA protein for designing biosensor scaffolds that allow measurement of pH and Ca2+ gradients by fluorescence intensity and lifetime imaging (FLIM) detection modes. By fusing CBD with pH-sensitive enhanced cyan fluorescent protein (CBD-ECFP), we achieved efficient labeling of cellulose-based scaffolds based on nanofibrillar, bacterial cellulose, and decellularized plant materials. CBD-ECFP bound to the cellulose matrices demonstrated pH sensitivity comparable to untagged ECFP (1.9–2.3 ns for pH 6–8), thus making it compatible with FLIM-based analysis of extracellular pH. By using 3D culture of human colon cancer cells (HCT116) and adult stem cell-derived mouse intestinal organoids, we evaluated the utility of the produced biosensor scaffold. CBD-ECFP was sensitive to increases in extracellular acidification: the results showed a decline in 0.2–0.4 pH units in response to membrane depolarization by the protonophore FCCP. With the intestinal organoid model, we demonstrated multiparametric imaging by combining extracellular acidification (FLIM) with phosphorescent probe-based monitoring of cell oxygenation. The described labeling strategy allows for the design of extracellular pH-sensitive scaffolds for multiparametric FLIM assays and their use in engineered live cancer and stem cell-derived tissues. Collectively, this research can help in achieving the controlled biofabrication of 3D tissue models with known metabolic characteristics. Statement of Significance: We designed biosensors consisting of a cellulose-binding domain (CBD) and pH- and Ca2+-sensitive fluorescent proteins. CBD-tagged biosensors efficiently label various types of cellulose matrices including nanofibrillar cellulose and decellularized plant materials. Hybrid biosensing cellulose scaffolds designed in this study were successfully tested by multiparameter FLIM microscopy in 3D cultures of cancer cells and mouse intestinal organoids.

© 2018, Springer International Publishing AG, part of Springer Nature.  Molecular oxygen (O 2 ) is a key player in cell mitochondrial function, redox balance and oxidative stress, normal tissue function and many common disease states. Various chemical, physical and biological methods have been proposed for measurement, real-time monitoring and imaging of O 2 concentration, state of decreased O 2 (hypoxia) and related parameters in cells and tissue. Here, we review the established and emerging optical microscopy techniques allowing to visualize O 2 levels in cells and tissue samples, mostly under in vitro and ex vivo, but also under in vivo settings. Particular examples include fluorescent hypoxia stains, fluorescent protein reporter systems, phosphorescent probes and nanosensors of different types. These techniques allow high-resolution mapping of O 2 gradients in live or post-mortem tissue, in 2D or 3D, qualitatively or quantitatively. They enable control and monitoring of oxygenation conditions and their correlation with other biomarkers of cell and tissue function. Comparison of these techniques and corresponding imaging setups, their analytical capabilities and typical applications are given.

Количественное измерение рН и градиентов метаболитов с помощью микроскопии является одной из задач при производстве карбоорганических органоидов и многоклеточных агрегатов. Здесь мы использовали целлюлозосвязывающий домен (CBD) белка Cellulomonas fimi CenA для создания биосенсорных каркасов, которые позволяют измерять pH и Ca 2+.градиенты по интенсивности флуоресценции и режимам обнаружения времени жизни (FLIM). Путем слияния CBD с pH-чувствительным улучшенным голубым флуоресцентным белком (CBD-ECFP) мы добились эффективной маркировки каркасов на основе целлюлозы, основанных на нанофибриллах, бактериальной целлюлозе и децеллюляризованных растительных материалах. CBD-ECFP, связанный с целлюлозными матрицами, продемонстрировал чувствительность к pH, сопоставимую с немеченым ECFP (1,9-2,3 нс для pH 6-8), что делает его совместимым с анализом внеклеточного pH на основе FLIM. Используя 3D-культуру раковых клеток толстой кишки человека (HCT116) и кишечных органоидов мышей, полученных из стволовых клеток взрослых, мы оценили полезность полученных биосенсорных каркасов. CBD-ECFP был чувствителен к увеличению внеклеточного подкисления: результаты показали снижение на 0,2-0,4 единиц pH в ответ на деполяризацию мембраны протонофором FCCP. На модели кишечных органоидов мы продемонстрировали многопараметрическую визуализацию, комбинируя внеклеточное подкисление (FLIM) с мониторингом оксигенации клеток на основе фосфоресцентного зонда. Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca2+ -чувствительные флуоресцентные белки. Биодатчики с меткой CBD эффективно маркируют различные типы целлюлозных матриц, включая нанофибриллярную целлюлозу и децеллюляризованные растительные материалы. Гибридные биосенсорные целлюлозные каркасы, разработанные в этом исследовании, были успешно протестированы многопараметрической FLIM-микроскопией в 3D-культурах раковых клеток и кишечных органоидов мыши.

Количественное измерение рН и градиентов метаболитов с помощью микроскопии является одной из задач при производстве карбоорганических органоидов и многоклеточных агрегатов. Здесь мы использовали целлюлозосвязывающий домен (CBD) белка Cellulomonas fimi CenA для создания биосенсорных каркасов, которые позволяют измерять pH и Ca 2+.градиенты по интенсивности флуоресценции и режимам обнаружения времени жизни (FLIM). Путем слияния CBD с pH-чувствительным улучшенным голубым флуоресцентным белком (CBD-ECFP) мы добились эффективной маркировки каркасов на основе целлюлозы, основанных на нанофибриллах, бактериальной целлюлозе и децеллюляризованных растительных материалах. CBD-ECFP, связанный с целлюлозными матрицами, продемонстрировал чувствительность к pH, сопоставимую с немеченым ECFP (1,9-2,3 нс для pH 6-8), что делает его совместимым с анализом внеклеточного pH на основе FLIM. Используя 3D-культуру раковых клеток толстой кишки человека (HCT116) и кишечных органоидов мышей, полученных из стволовых клеток взрослых, мы оценили полезность полученных биосенсорных каркасов. CBD-ECFP был чувствителен к увеличению внеклеточного подкисления: результаты показали снижение на 0,2-0,4 единиц pH в ответ на деполяризацию мембраны протонофором FCCP. На модели кишечных органоидов мы продемонстрировали многопараметрическую визуализацию, комбинируя внеклеточное подкисление (FLIM) с мониторингом оксигенации клеток на основе фосфоресцентного зонда. Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca2+ -чувствительные флуоресцентные белки. Биодатчики с меткой CBD эффективно маркируют различные типы целлюлозных матриц, включая нанофибриллярную целлюлозу и децеллюляризованные растительные материалы. Гибридные биосенсорные целлюлозные каркасы, разработанные в этом исследовании, были успешно протестированы многопараметрической FLIM-микроскопией в 3D-культурах раковых клеток и кишечных органоидов мыши.