Репозиторий Университета

Репликативный полипротеин 1а вируса желтухи свеклы (ВЖС) содержит консервативные домены лидерной папаин-подобной протеиназы (РСР), метилтрансферазы (MTR) и РНК хеликазы (HEL). Центральный район (central region, CR) между MTR и HEL ранее считали «вариабельным». Нами проведен компьютерный анализ CR, который позволил выявить новый консервативный домен между позициями 1287-1390 (здесь и далее приводится нумерация аминокислотных остатков белка 1а вируса желтухи свеклы, BYV), сохраняющийся у всех представителей рода Closterovirus. Этот домен содержит 4 предсказанных альфа-спиральных участка (альфа А – D) и три строго консервативные позиции – глютамат-1291, пролин-1380 и аргинин-1384. Кроме того, биоинформатический анализ позволил предсказать амфипатическую спираль в позициях 1368-1380 (входящую в состав участка альфа D). Гидрофобный домен CR-2 (позиции 1305-1494 белка 1а), вызывающий при экспрессии в растениях реструктуризацию эндоплазматического ретикулюма и образование подвижных глобул диаметром ~1 мкм, включает участки альфа В, С и D. Установлено, что экспрессия в растениях слитных белков CR-2:GFP и GFP:CR-2 вызывает сходный «глобулообразующий» фенотип, т.е. N-концевое или C-концевое положение маркера GFP в слитном белке не влияет на переформатирование мембран эндоплазматического ретикулюма. Проведен делеционный анализ CR-2 BYV. Показано, что делеционные варианты 1355-1494 и 1325-1484 сохраняют фенотип дикого типа (образование глобул и реструктуризация ЭР вокруг ядра клетки). Варианты 1375-1484, 1368-1484 и 1368-1432 индуцировали образование глобул, но утрачивали способность к реструктуризации ЭР. Внесение замен гидрофобных аминокислотных остатков на остатки серина и глицина в «минимальном» делеционном мутанте 1368-1432 блокировало образование глобул. Предложена рабочая гипотеза о влиянии консервативной амфипатической спирали 1368-1385 в белке 1а BYV на ремоделирование мембран ЭР растительной клетки и создание репликативных платформ при клостеровирусной инфекции.

Human B-cell receptor-associated protein BAP31 (HsBAP31) is the endoplasmic reticulum-resident protein involved in protein sorting and transport as well as pro-apoptotic signaling. Plant orthologs of HsBAP31 termed 'plant BAP-like proteins' (PBL proteins) have thus far remained unstudied. Recently, the PBL protein from Nicotiana tabacum (NtPBL) was identified as an interactor of Nt-4/1, a plant protein known to interact with plant virus movement proteins and affect the long-distance transport of potato spindle tuber viroid (PSTVd) via the phloem. Here, we have compared the sequences of PBL proteins and studied the biochemical properties of NtPBL. Analysis of a number of fully sequenced plant genomes revealed that PBL-encoding genes represent a small multigene family with up to six members per genome. Two conserved motifs were identified in the C-terminal region of PBL proteins. The NtPBL C-terminal hydrophilic region (NtPBL-C) was expressed in bacterial cells, purified, and used for analysis of its RNA binding properties in vitro. In gel shift experiments, NtPBL-C was found to bind several tested RNAs, showing the most efficient binding to microRNA precursors (pre-miRNA) and less efficient interaction with PSTVd. Mutational analysis suggested that NtPBL-C has a composite RNA-binding site, with two conserved lysine residues in the most C-terminal protein region being involved in binding of pre-miRNA but not PSTVd RNA. Virus-mediated transient expression of NtPBL-C in plants resulted in stunting and leaf malformation, developmental abnormalities similar to those described previously for blockage of miRNA biogenesis/function. We hypothesize that the NtPBL protein represents a previously undiscovered component of the miRNA pathway.

Репликативный полипротеин 1а вируса желтухи свеклы (ВЖС) содержит консервативные домены лидерной папаин-подобной протеиназы (РСР), метилтрансферазы (MTR) и РНК хеликазы (HEL). Центральный район (central region, CR) между MTR и HEL ранее считали «вариабельным». Нами проведен компьютерный анализ CR, который позволил выявить новый консервативный домен между позициями 1287-1390 (здесь и далее приводится нумерация аминокислотных остатков белка 1а вируса желтухи свеклы, BYV), сохраняющийся у всех представителей рода Closterovirus. Этот домен содержит 4 предсказанных альфа-спиральных участка (альфа А – D) и три строго консервативные позиции – глютамат-1291, пролин-1380 и аргинин-1384. Кроме того, биоинформатический анализ позволил предсказать амфипатическую спираль в позициях 1368-1380 (входящую в состав участка альфа D). Гидрофобный домен CR-2 (позиции 1305-1494 белка 1а), вызывающий при экспрессии в растениях реструктуризацию эндоплазматического ретикулюма и образование подвижных глобул диаметром ~1 мкм, включает участки альфа В, С и D. Установлено, что экспрессия в растениях слитных белков CR-2:GFP и GFP:CR-2 вызывает сходный «глобулообразующий» фенотип, т.е. N-концевое или C-концевое положение маркера GFP в слитном белке не влияет на переформатирование мембран эндоплазматического ретикулюма. Проведен делеционный анализ CR-2 BYV. Показано, что делеционные варианты 1355-1494 и 1325-1484 сохраняют фенотип дикого типа (образование глобул и реструктуризация ЭР вокруг ядра клетки). Варианты 1375-1484, 1368-1484 и 1368-1432 индуцировали образование глобул, но утрачивали способность к реструктуризации ЭР. Внесение замен гидрофобных аминокислотных остатков на остатки серина и глицина в «минимальном» делеционном мутанте 1368-1432 блокировало образование глобул. Предложена рабочая гипотеза о влиянии консервативной амфипатической спирали 1368-1385 в белке 1а BYV на ремоделирование мембран ЭР растительной клетки и создание репликативных платформ при клостеровирусной инфекции.

Human B-cell receptor-associated protein BAP31 (HsBAP31) is the endoplasmic reticulum-resident protein involved in protein sorting and transport as well as pro-apoptotic signaling. Plant orthologs of HsBAP31 termed 'plant BAP-like proteins' (PBL proteins) have thus far remained unstudied. Recently, the PBL protein from Nicotiana tabacum (NtPBL) was identified as an interactor of Nt-4/1, a plant protein known to interact with plant virus movement proteins and affect the long-distance transport of potato spindle tuber viroid (PSTVd) via the phloem. Here, we have compared the sequences of PBL proteins and studied the biochemical properties of NtPBL. Analysis of a number of fully sequenced plant genomes revealed that PBL-encoding genes represent a small multigene family with up to six members per genome. Two conserved motifs were identified in the C-terminal region of PBL proteins. The NtPBL C-terminal hydrophilic region (NtPBL-C) was expressed in bacterial cells, purified, and used for analysis of its RNA binding properties in vitro. In gel shift experiments, NtPBL-C was found to bind several tested RNAs, showing the most efficient binding to microRNA precursors (pre-miRNA) and less efficient interaction with PSTVd. Mutational analysis suggested that NtPBL-C has a composite RNA-binding site, with two conserved lysine residues in the most C-terminal protein region being involved in binding of pre-miRNA but not PSTVd RNA. Virus-mediated transient expression of NtPBL-C in plants resulted in stunting and leaf malformation, developmental abnormalities similar to those described previously for blockage of miRNA biogenesis/function. We hypothesize that the NtPBL protein represents a previously undiscovered component of the miRNA pathway.