Аннтотация

Количественное измерение рН и градиентов метаболитов с помощью микроскопии является одной из задач при производстве карбоорганических органоидов и многоклеточных агрегатов. Здесь мы использовали целлюлозосвязывающий домен (CBD) белка Cellulomonas fimi CenA для создания биосенсорных каркасов, которые позволяют измерять pH и Ca 2+.градиенты по интенсивности флуоресценции и режимам обнаружения времени жизни (FLIM). Путем слияния CBD с pH-чувствительным улучшенным голубым флуоресцентным белком (CBD-ECFP) мы добились эффективной маркировки каркасов на основе целлюлозы, основанных на нанофибриллах, бактериальной целлюлозе и децеллюляризованных растительных материалах. CBD-ECFP, связанный с целлюлозными матрицами, продемонстрировал чувствительность к pH, сопоставимую с немеченым ECFP (1,9-2,3 нс для pH 6-8), что делает его совместимым с анализом внеклеточного pH на основе FLIM. Используя 3D-культуру раковых клеток толстой кишки человека (HCT116) и кишечных органоидов мышей, полученных из стволовых клеток взрослых, мы оценили полезность полученных биосенсорных каркасов. CBD-ECFP был чувствителен к увеличению внеклеточного подкисления: результаты показали снижение на 0,2-0,4 единиц pH в ответ на деполяризацию мембраны протонофором FCCP. На модели кишечных органоидов мы продемонстрировали многопараметрическую визуализацию, комбинируя внеклеточное подкисление (FLIM) с мониторингом оксигенации клеток на основе фосфоресцентного зонда. Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca Описанная стратегия мечения позволяет создавать внеклеточные pH-чувствительные каркасы для многопараметрических анализов FLIM и их использования в тканях живого рака и стволовых клеток. В совокупности это исследование может помочь в достижении контролируемого биофабрикации трехмерных моделей тканей с известными метаболическими характеристиками. ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ: Мы разработали биосенсоры, состоящие из целлюлозо-связывающего домена (CBD) и pH- и Ca2+ -чувствительные флуоресцентные белки. Биодатчики с меткой CBD эффективно маркируют различные типы целлюлозных матриц, включая нанофибриллярную целлюлозу и децеллюляризованные растительные материалы. Гибридные биосенсорные целлюлозные каркасы, разработанные в этом исследовании, были успешно протестированы многопараметрической FLIM-микроскопией в 3D-культурах раковых клеток и кишечных органоидов мыши.